顯微操作技術(shù)(倒置顯微鏡)（micromanipulation technique）

顯微操作技術(shù)（micromanipulation technique）是指在高倍復(fù)式顯微鏡下，利用顯微操作器（micromanipulator）進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機(jī)械裝置。


顯微操作的基礎(chǔ)平臺--倒置研究級顯微鏡（例如caikon XDS-500C）各種活細(xì)胞應(yīng)用實(shí)驗(yàn)，如顯微操作、細(xì)胞培養(yǎng)，IVF，ICSI等.   
顯微操作技術(shù)（micromanipulation technique）是指在高倍復(fù)式顯微鏡下，利用顯微操作器（micromanipulator），這是一套能控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機(jī)械裝置，用來進(jìn)行細(xì)胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作技術(shù)包括細(xì)胞核移植、顯微注射、嵌合體技術(shù)、胚胎移植以及顯微切割等，像是桃莉羊的產(chǎn)制就是運(yùn)用細(xì)胞核移植技術(shù)達(dá)成的；而基因轉(zhuǎn)殖（gene transfer）指的是將選殖之外源基因藉由導(dǎo)入體細(xì)胞并能穩(wěn)定的嵌入宿主動物之生殖細(xì)胞染色體中之一門技術(shù)，基因轉(zhuǎn)殖動物被定義為經(jīng)由人為的方式將外源基因引入體內(nèi)而引起基因改變之動物，并可將遺傳特質(zhì)傳遞至接續(xù)的每一世代中。產(chǎn)制基因轉(zhuǎn)殖動物可利用基因顯微注射（gene microinjection）、胚干細(xì)胞（embryonic stem cells, ES cells）、精子載體（sperm vector）、反轉(zhuǎn)錄病毒感染（retroviral vector infection）及體細(xì)胞核移置（somatic cell nuclear transfer）等方法達(dá)成，其中顯微注射為目前應(yīng)用zui普遍之方法之一。顯微注射法（microinjection）是利用管尖極細(xì)（0.1至0.5 μm）的玻璃微量注射針，將選殖之外源基因片段直接注射入原核期胚或是培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生之重排（rearrangement）、刪除（deletion）、重復(fù)（duplication）或易位（translocation）等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主之染色體內(nèi)。這種顯微注射術(shù)的程序，需有相當(dāng)精密的顯微操作設(shè)備，于制造長管尖時，需用微量吸管拉長器（micropipette puller），注射時需有固定管尖位置的微量操縱器。這種技術(shù)的長處為任何DNA在原則上均可傳入任何種類的細(xì)胞內(nèi)。此法已成功的產(chǎn)制包括小鼠（mouse）、魚、大鼠（rat）、兔子及許多大型家畜，如牛、羊、豬等基因轉(zhuǎn)殖動物。以顯微注射法轉(zhuǎn)殖之外源基因較無長度上之限制，目前已證明數(shù)百kb之DNA片段均可成功產(chǎn)制出基因轉(zhuǎn)殖動物。而其缺點(diǎn)為其設(shè)備經(jīng)密昂貴、操作技術(shù)需要有相當(dāng)時間的練習(xí)，及每次只能注射相當(dāng)有限的細(xì)胞。

2007-09-16 09:33 用于顯微注射用之顯微鏡常使用具有位相差(phasecontrast)與微分干涉差(differential interference contrast)功能之倒置顯微鏡(例如上海蔡康光學(xué)儀器廠的倒置顯微鏡XDS-300C或者XDS-500D)，倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，一般正置顯微鏡之物鏡在載物臺之上，照明系統(tǒng)在下，而倒立式顯微鏡之物鏡在下與而照明系統(tǒng)在載物臺之上，倒立式顯微鏡之優(yōu)點(diǎn)為接物鏡與目鏡間之工作距離較長，可直接將培養(yǎng)皿之置顯微鏡操作臺上進(jìn)行顯微注射等工作。傳統(tǒng)之一般普通顯微鏡無法直接觀察未經(jīng)染色之透明的活細(xì)胞，為了能讓顯微注射技術(shù)觀察與操作透明的活細(xì)胞樣品，顯微鏡須使用具有位相差與微分干涉差功能之倒立式顯微鏡。位相差顯微鏡是由P．Zernike于1932年發(fā)明，并因此獲得1953年諾貝爾物理獎，這種顯微鏡zui大的特點(diǎn)是可以觀察未經(jīng)染色的透明標(biāo)本和活細(xì)胞，位相差顯微鏡的基本原理是利用透明細(xì)胞檢體內(nèi)部折射率各不相同，把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對比度，得到明暗對比的效果，使的透明活細(xì)胞各種結(jié)構(gòu)內(nèi)部細(xì)節(jié)在亮背景視野中變得清晰可見，位相差顯微鏡之基本構(gòu)造是利用位相差聚光鏡及內(nèi)部位相環(huán)所構(gòu)成的環(huán)狀光圈，光通過聚光鏡后，產(chǎn)生中空光錐，并在光線穿過檢體后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ（波長），如果再經(jīng)過物鏡內(nèi)的光延遲位環(huán)板而成增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減下提高反差。雖然相差顯微鏡可以在透明的細(xì)胞樣品提供清析的觀察圖像，但是一般位相差顯微鏡的缺點(diǎn)是會有「光暈」現(xiàn)象的產(chǎn)生，因而導(dǎo)致觀察的景深受限制，無法用以觀察較厚的樣品，較厚的細(xì)胞團(tuán)區(qū)域在一般位相差顯微鏡下的清稀度十分糟糕，而且邊緣常產(chǎn)生暈輪效果，如果觀察樣品中有超過85%以上的區(qū)域?yàn)檩^厚細(xì)胞時，這個問題將非常嚴(yán)重，然而顯微注射用之樣品如受精卵細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)均具有一定厚度，造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)和邊緣無法清楚可見，因此顯微注射用的顯微鏡必須要能克服厚樣品的問題。

2007-09-16 09:34 為解決活動樣品和厚樣品帶有「光暈」的觀察問題，1952年，Nomarski在相差顯微鏡原理的基礎(chǔ)上發(fā)明了微分干涉差顯微鏡（differential interference contrast microscope）。Nomarski 微分干涉差顯微鏡之優(yōu)點(diǎn)是能顯示結(jié)構(gòu)的三維立體投影影像，與傳統(tǒng)位相差顯微鏡相比，其標(biāo)本可略厚一點(diǎn)，折射率差別更大，故影像的立體感更強(qiáng)，產(chǎn)生類似于浮雕的效果。微分干涉差顯微鏡技術(shù)設(shè)計(jì)比相差顯微鏡要復(fù)雜得多，Nomarski DIC利用的是偏振光，有四個特殊的光學(xué)組件：偏振器（polarizer）、DIC棱鏡、DIC滑行器和檢偏器（analyzer）。偏振器直接裝在聚光系統(tǒng)的前面，使光線發(fā)生線性偏振。在聚光器中則安裝了二個楔形單軸的晶體,如石英,以光軸互相交錯的方式互相接合，稱為Wollaston棱鏡或Nomarski棱鏡，即DIC棱鏡，此棱鏡可將每一光線分離成為二條偏振互相垂直的兩束光（x和y），二者成一小夾角，聚光器將兩束光調(diào)整成與顯微鏡光軸平行的方向。zui初兩束光相位一致，在穿過標(biāo)本相鄰的區(qū)域后，由于標(biāo)本的厚度和折射率不同，引起了兩束光發(fā)生了光程差。在物鏡的后焦面處安裝了第二個Wollaston棱鏡，即DIC滑行器，它把兩束光波合并成一束，這時兩束光的偏振面（x和y）仍然存在。zui后光束穿過第二個偏振裝置，即檢偏器，在光束形成目鏡DIC影像之前，檢偏器與偏光器的方向成直角，檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振面的兩束光，從而使二者發(fā)生干涉。x和y波的光程差決定著透光的多少，當(dāng)光程差值為0時，沒有光穿過檢偏器；光程差值等于波長一半時，穿過的光達(dá)到zui大值，于是在灰色的背景上，標(biāo)本結(jié)構(gòu)便呈現(xiàn)出亮暗差。為了使影像的反差達(dá)到*狀態(tài)，觀察者可通過調(diào)節(jié)DIC滑行器的縱行微調(diào)來改變光程差，改變光程差可以改變影像的亮度。而調(diào)節(jié)DIC滑行器則可使標(biāo)本的細(xì)微結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出正或負(fù)的投影形象，通常是一側(cè)亮，而另一側(cè)暗，這便造成了標(biāo)本的人為三維立體感，產(chǎn)生了類似大理石上的浮雕感覺。 DIC顯微鏡使細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，特別是一些較大的細(xì)胞器，如核、線粒體等，立體感特別強(qiáng)，因此適合應(yīng)用于顯微操作技術(shù)。目前像基因注入、核移植、轉(zhuǎn)基因等的顯微操作常需要在這種顯微鏡下進(jìn)行。 雖然Nomarski微分干涉技術(shù)可以對付一些細(xì)胞團(tuán)或者組織等較厚的樣品，但它非常昂貴，并且僅僅只能應(yīng)用在玻璃底的培養(yǎng)皿中，無法直接在廣為研究人員進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)操作之一般塑料材質(zhì)的培養(yǎng)皿產(chǎn)生浮雕效果，此外這種技術(shù)對于顯微操作技術(shù)的所使用的樣品而言，景深還是稍嫌不足，因此在應(yīng)用上遇到不少問題。有鑒于此，一些其它的可以用于觀察厚樣品的微分干涉技術(shù)也逐漸被開發(fā)出來，    例如上海蔡康光學(xué)儀器廠就推出了自己的浮雕相襯（RC）裝置蔡康浮雕相襯系統(tǒng)能夠產(chǎn)生高反差的3D 圖像，類似于DIC效果，可用于塑料器皿中的樣品。浮雕相襯用于細(xì)胞受精，使細(xì)胞核膜更容易看到和穿刺。 適應(yīng)于所有類型的細(xì)胞,組織(無論活體,染色,未染色),晶體表面細(xì)節(jié),透明聚合物,玻璃和其它類似材料,尤其適應(yīng)于顯微操作實(shí)驗(yàn).

2007-09-16 09:34 目前zui常用來生產(chǎn)基因轉(zhuǎn)殖動物的方式為：直接把重組過的 DNA 注入授精卵的原核 (pronuleus) 中，將從胚胎提供者的輸卵管中取得的授精卵移到倒立式顯微鏡上的微量注射臺上，然后利用固定吸量管 (holding pipette) 固定住，之后注射針則依序穿過 zona pellucida，oocyte membrance及male pronuleus membrane后，將 DNA 注入，注入時可以見到原核膨大。以小鼠受精卵雄原核之顯微注射為例，顯微注射所使用的受精卵之固定吸管（holding pipette）及注射針（injection needle）之制備困難，除影響操作時間外，亦是影響基因轉(zhuǎn)殖效率及基因注入后之胚存活及基因轉(zhuǎn)殖成功與否極其重要的因子。固定吸管之內(nèi)、外徑分別為30、80 μm較為適當(dāng)?shù)摹ｏ@微注射針自針尖起20 μm處之外徑為4 μm時，可獲得良好的轉(zhuǎn)殖效率。固定吸管之內(nèi)徑如太小，會導(dǎo)致吸力不足，對受精卵操控不易，如太大，則受精卵易受傷害，影響胚之存活率。顯微注射針尖如太粗，則導(dǎo)致插入透明帶及原核之阻力增加，且DNA流量過多，受精卵易于裂解，太細(xì)則致針內(nèi)DNA流出速率過慢，且易阻塞，而使DNA無法順利流入原核內(nèi)，影響注射效率。因此進(jìn)行受精卵雄原核之顯微注射時，如何制備適用之固定受精卵之吸管及顯微注射針是關(guān)乎基因轉(zhuǎn)殖效率極其重要的因素。 基因轉(zhuǎn)殖動物（transgenic animal）于目前生物及醫(yī)學(xué)研究方面之應(yīng)用極為廣泛，基因轉(zhuǎn)殖小鼠一直是研究外源基因構(gòu)筑型態(tài)、染色體嵌插、轉(zhuǎn)殖基因表現(xiàn)及調(diào)節(jié)之*模式，也是建立基因轉(zhuǎn)殖技術(shù)的工具，尤其是在產(chǎn)制基因轉(zhuǎn)殖家畜之前，如能先以小鼠進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)是求事半功倍*之過程?；蜣D(zhuǎn)殖動物應(yīng)用的領(lǐng)域可以包括研究基因的活動對致癌病毒與癌細(xì)胞的生長的影響、基因的活動與免疫細(xì)胞間的交互作用與調(diào)控的機(jī)制、研究基因?qū)τ谏L的調(diào)控機(jī)制，以及生物學(xué)與遺傳學(xué)的機(jī)制，也被應(yīng)用于以人類細(xì)胞作為組織及器官移植的發(fā)展方面，如基因參與體細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞及存在各個組織的干細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化研究等等?；蜣D(zhuǎn)殖動物除用于一般基礎(chǔ)研究外，對于制造具治療效果的蛋白質(zhì)、器官移植、疫苗、毒理實(shí)驗(yàn)、動物品種改良及水產(chǎn)養(yǎng)殖等均有很大的貢獻(xiàn)。雖然截至目前為止，基因轉(zhuǎn)殖之研發(fā)已有若干良好的成果，但尚有若干問題待克服，所以基因轉(zhuǎn)殖技術(shù)之應(yīng)用與發(fā)展將是*